1. Pengertian HPLC
Kromatografi
cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC)
merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zatcair yang biasanya disertai
dengan tekanan tinggi. HPLC digunakan untuk
memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat
tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya
merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan
beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif
antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detector
serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatogram memuat waktu
tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.
Pemisahan
dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih
polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya
kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua
pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase
normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat
dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada
mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
·
Kromatografi Adsorbsi
Prinsip
kromatografi adsorbsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan
kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan
fase normal dengan menggunakan fase diam silica gel dan alumina, meskipun
demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat
gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika
mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat
sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.
·
Kromatografi fase terikat
Kebanyakan
fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau
fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana,
atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah
oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau
dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah,
peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut
akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi
ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika
solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang
mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
·
Kromatografi penukar ion
KCKT
penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan
suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun
demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan
pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat
ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol
dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air,
retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta
oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi
solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan
ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
·
Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi
pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan
mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik
ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.
·
Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi
ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk
memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase
diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus
sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi
lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan
terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan
terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan
BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase
diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi
interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.
·
Kromatografi Afinitas
Pemisahan terjadi karena
interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung
gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi
yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai
(sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis
ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat
kompleks.
3. Beberapa
kegunaan dari HPLC :
·
HPLC dengan prinsip kromatografi
banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
·
Zat- zat dengan kepolaran berbeda
yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC
berdasarkan partisi cair-cair.
·
Asam-asam nukleat dapat
dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran
berlapis zat berpori.
·
Morfin, heroin dan semacamnya
telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
·
Dapat memisahkan vitamin- vitamin
yang larut dalam air.
·
Digunakan untuk menentukan berat
molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
·
Dapat digunakan untuk
memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.
4. Aplikasi dalam ilmiah
Perkembangan
yang baru-baru ini HPLC telah menjadi pengembangan metode HPLC denaturing
(DHPLC). This procedure can separate double-stranded DNA molecules that differ
by as little as one . Prosedur ini dapat memisahkan molekul DNA untai-ganda
yang berbeda sekecil satu pasangan basa .The speed of analysis (approximately 5 minutes per sample) and the
size of DNA fragment that can be analyzed (up to 2.0 kilobytes) has made it a
preferred method for a variety of applications in the field of molecular
biology. Kecepatan analisis (sekitar 5 menit per sampel) dan ukuran fragmen DNA
yang dapat dianalisis (hingga 2,0 kilobyte) telah membuatnya menjadi metode
yang disukai untuk berbagai aplikasi dalam bidang biologi
molekuler.Applications of DHPLC include the detection of single nucleotide
(SNPs). Aplikasi DHPLC termasuk deteksi tunggal nukleotida polimorfisme (SNP). These are single base-pair variations in DNA that can give
valuable information on genetic variation within a population. Ini adalah satu
dasar pasangan variasi dalam DNA yang dapat memberikan informasi berharga
tentang variasi genetik dalam suatu populasi, They can also help to identify the genes that cause certain human
diseases.dan juga dapat membantu untuk mengidentifikasi gen yang
menyebabkan penyakit manusia tertentu. Dan aplikasi lain dari kromatrogarafi
HPLC adalah dalam dunia farmasi digunakan untuk menganalisis.
Contoh analisis menggunakan
kromatrografi HPLC:
·
Analisis Diazepam dalam darah
Diazepam (Valium) merupakan
Senyawa golongan psikotropika. Senyawa ini berbentuk kristal agak
kekuningan yang tidak larut dalam air,
rumus kimiaC23H27N. Diazepam
termasuk obat antiansietas, antikonvulsan, dan sedatif.
Mempunyai Indikasi untuk status epileptikus, ansietas atau insomnia,
konvulsi akibat keracunan, kejang demam, dan sebagai obat penenang. Prinsip cara uji
diazepam ini adalah dengan mengekstraksi menggunakan pelarut atau campuran
pelarut yang sesuai. Kemudian sampel yang sudah melalui proses preparasi
selanjutnya diinjeksikan ke sistem HPLC.
5. Kelebihan dan Kekurangan Dalam Penggunaan HPLC
Dengan
adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi. Berikut
merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain:
·
Mampu memisahkan molekul-molekul
dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi.
·
Dapat dihindari terjadinya
dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
·
Dapat digunakan bermacan-macam
detektor dengan kepekaan yang tinggi.
·
Kolom dapat digunakan kembali.
·
Waktu analisa cukup singkat.
·
HPLC dapat digunakan untuk
isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.
·
Dapat menganalisis sampel yang
kecil kuantitasnya.
·
Teknik HPLC dapat dilakukan pada
suhu kamar.
Kelemahan dari alat HPLC antara lain:
·
Harga sebuah alat HPLC cukup
mahal.
·
Sering ada larutan standar yang
tertinggal diinjektor.
·
Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan
ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah
tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus
dijaga.
6. Prinsip
kerja
Pada
dasarnya prinsip kerja HPLC sama dengan kromatografi lapis tipis dan
kromatografi kolom, yang membedakan adalah fasa diam yang digunakan pada HPLC
memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga
keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien.
Pada HPLC tekanan yang tinggi
menyebabkan fasa gerak dapat bergerak lebih cepat sehingga difusi menjadi
sekecil-kecilnya. Ukuran butir kecil pada fasa diam dan tekanan yang tinggi
pada fasa gerak pada kromatografi kolom cair secara teori akan menghasilkan
pemisahan yang sebaik-baiknya.
·
Injeksi
sampel
Injeksi sample seluruhnya dilakukan
secara otomatis sehingga tidak bisa mengetahui yang terjadi pada keadaan
tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan
kromatografi gas.
· Waktu retensi
Waktu
yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor
disebut sebagai waktu retensi.Waktu retensi diukur berdasarkan waktu
dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang
maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi
yang berbeda pula. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi
dan bergantung pada:
a.
Tekanan yang digunakan (karena
itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut).
b.
Kondisi dari fase diam (tidak
hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel).
c.
Komposisi yang tepat dari pelarut.
d.
Temperatur pada kolom.
·
Detektor
Ada
beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum
yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet. Banyak
senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang.
Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada
jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu.
·
Interpretasi
output dari detector
Output
akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak
mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar
UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom,dapat menggunakan waktu retensi
untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh.
Area
yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan
area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.Area dihitung
sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
DAFTAR
PUSTAKA
Basset, J., Denney, R. C., Jeffrey, G. H., dan Mendham, J., 1994, Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik,
Buku Kedokteran-EGC, Jakarta.
Day R.A
dan Underwood A.L., 1999, Analisa Kimia
Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.
Harjadi,
W., 1993, Ilmu Kimia Analitik Dasar,
PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Harjadi, W., 1884, Ilmu Kimia Analitik Dasar, PT Gramedia,
Jakarta.
Khopkar S.M., 2003, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar