High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

1.    Pengertian HPLC

            Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zatcair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detector serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatogram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

2.    JENIS- JENIS HPLC

            Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

·      Kromatografi Adsorbsi

   Prinsip kromatografi adsorbsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silica gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

·      Kromatografi fase terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

·      Kromatografi penukar ion

       KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

·      Kromatografi Pasangan ion

       Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

·      Kromatografi Eksklusi Ukuran

       Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

·      Kromatografi Afinitas

       Pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

3.    Beberapa kegunaan dari HPLC :

·      HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.

·      Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.

·      Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.

·      Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.

·      Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.

·      Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.

·      Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.

4.    Aplikasi dalam ilmiah

       Perkembangan yang baru-baru ini HPLC telah menjadi pengembangan metode HPLC denaturing (DHPLC). This procedure can separate double-stranded DNA molecules that differ by as little as one . Prosedur ini dapat memisahkan molekul DNA untai-ganda yang berbeda sekecil satu pasangan basa .The speed of analysis (approximately 5 minutes per sample) and the size of DNA fragment that can be analyzed (up to 2.0 kilobytes) has made it a preferred method for a variety of applications in the field of molecular biology. Kecepatan analisis (sekitar 5 menit per sampel) dan ukuran fragmen DNA yang dapat dianalisis (hingga 2,0 kilobyte) telah membuatnya menjadi metode yang disukai untuk berbagai aplikasi dalam bidang biologi molekuler.Applications of DHPLC include the detection of single nucleotide (SNPs). Aplikasi DHPLC termasuk deteksi tunggal nukleotida polimorfisme (SNP). These are single base-pair variations in DNA that can give valuable information on genetic variation within a population. Ini adalah satu dasar pasangan variasi dalam DNA yang dapat memberikan informasi berharga tentang variasi genetik dalam suatu populasi,  They can also help to identify the genes that cause certain human diseases.dan  juga dapat membantu untuk mengidentifikasi gen yang menyebabkan penyakit manusia tertentu. Dan aplikasi lain dari kromatrogarafi HPLC adalah dalam dunia farmasi digunakan untuk menganalisis.

Contoh analisis menggunakan kromatrografi HPLC:

·      Analisis Diazepam dalam darah

       Diazepam (Valium) merupakan Senyawa golongan psikotropika. Senyawa ini berbentuk kristal agak kekuningan yang tidak larut dalam air, rumus kimiaC₂₃H₂₇N. Diazepam termasuk obat  antiansietas, antikonvulsan, dan sedatif. Mempunyai Indikasi untuk status epileptikus, ansietas atau insomnia, konvulsi akibat keracunan, kejang demam, dan sebagai obat penenang. Prinsip cara uji diazepam ini adalah dengan mengekstraksi menggunakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Kemudian sampel yang sudah melalui proses  preparasi selanjutnya diinjeksikan ke sistem HPLC.

5.    Kelebihan dan Kekurangan Dalam Penggunaan HPLC

       Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi. Berikut merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain:

·      Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi.

·      Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.

·      Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.

·      Kolom dapat digunakan kembali.

·      Waktu analisa cukup singkat.

·      HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.

·      Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.

·      Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Kelemahan dari alat HPLC antara lain:

·      Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.

·      Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.

·      Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.

6.     Prinsip kerja

       Pada dasarnya prinsip kerja HPLC sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom, yang membedakan adalah fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien.

Pada HPLC tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak dapat bergerak lebih cepat sehingga difusi menjadi sekecil-kecilnya. Ukuran butir kecil pada fasa diam dan tekanan yang tinggi pada fasa gerak pada kromatografi kolom cair secara teori akan menghasilkan pemisahan yang sebaik-baiknya.

·      Injeksi sampel

       Injeksi sample seluruhnya dilakukan secara otomatis sehingga tidak bisa mengetahui yang terjadi pada keadaan tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.

·      Waktu retensi

       Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi.Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda pula. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

a.    Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut).

b.    Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel).

c.    Komposisi yang tepat dari pelarut.

d.    Temperatur pada kolom.

·      Detektor

            Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet. Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu.

·      Interpretasi output dari detector

       Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom,dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh.

            Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

DAFTAR PUSTAKA

  

Basset, J., Denney, R. C., Jeffrey, G. H., dan Mendham, J., 1994, Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik, Buku Kedokteran-EGC, Jakarta.

Day R.A dan Underwood A.L., 1999, Analisa Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.

Harjadi, W., 1993, Ilmu Kimia Analitik Dasar, PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.

Harjadi, W., 1884, Ilmu Kimia Analitik Dasar, PT Gramedia, Jakarta.

Khopkar S.M., 2003, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta.

DEFINISI SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS dan Penjelasannya

SPEKTROFOTOMETRI UV-Vis

A.       Pengertian Spektrofotometri UV-Vis

            Spektrofotometri UV-Vis adalah pengukuran serapan cahaya di daerah ultraviolet (200-400 nm) dan sinar tampak (400-800 nm) oleh suatu senyawa. Serapan cahaya uv atau cahaya tampak mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi elektron-elektron dari orbital dasar yang berenergi rendah ke orbital tereksitasi yang berenergi lebih tinggi. Panjang gelombang cahaya uv atau cahaya tampak bergantung pada mudahnya promosi elektron. Molekul- molekul yang memerlukan lebih banyak energi untuk promosi elektron, akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih pendek. Molekul yang memerlukan energi lebih sedikit akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih panjang. Senyawa yang menyerap cahaya dalam daerah tampak (senyawa berwarna) mempunyai elektron yang lebih mudah dipromosikan dari pada senyawa yang menyerap pada panjang gelombang lebih pendek (Herliani, 2008).

            Absorpsi spektrofotometri UV-Vis adalah istilah yang digunakan ketika radiasi ultraviolet dan cahaya tampak diabsorpsi oleh molekul yang diukur. Alatnya disebut spektrofotometer UV-Vis. Spektrofotometer UV-Vis (Ultra Violet-Visible) adalah salah satu instrumen yang digunakan dalam menganalisa suatu senyawa kimia. Spektrofotometer digunakan karena kemampuannya dalam menganalisa banyak senyawa kimia serta kepraktisannya dalam hal preparasi sampel apabila dibandingkan dengan beberapa metode analisa (Herliani, 2008).

B.  Pengertian Spektofotometer

       Spektrofotometer adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrometer ialah menghasilkan sinar dari spektrum dan panjang gelombang tertentu, sedangkan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi spektrofotometer adalah alat yang digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Kelebihan spektrometer dibandingkan fotometer adalah panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma, grating ataupun celah optis. Pada fotometer filter, sinar dengan panjang gelombang yang diinginkan diperoleh dengan berbagai filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. Pada fotometer filter, tidak mungkin diperoleh panjang gelombang yang benar-benar monokromatis, melainkan suatu trayek panjang gelombang 30-40 nm. Sedangkan pada spektrometer, panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorpsi untuk larutan sampel atau  blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorpsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding. (Khopkar, 1990).

C.  Kegunaan Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis pada umumnya digunakan untuk:

·         Menentukan jenis kromofor, ikatan rangkap yang terkonyugasi dan ausokrom dari suatu senyawa organik. 

• Menjelaskan informasi dari struktur berdasarkan panjang gelombang maksimum suatu senyawa. 
• Mampu menganalisis senyawa organik secara kuantitatif dengan menggunakan hukum  Lambert-Beer. 

Spektrofotometri UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorbsi oleh sampel. Sinar ultraviolet dan cahaya tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikan elektron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi. Spektroskopi UV-Vis biasanya digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau kompleks di dalam larutan. Spektrum UV-Vis mempunyai bentuk yang lebar dan hanya sedikit informasi tentang struktur yang bisa didapatkan dari spektrum ini sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif.  Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400 nm, sedangkan sinar tampak berada pada panjang gelombang 400-800nm.
            Panjang gelombang (λ) adalah jarak antara satu lembah dan satu puncak, sedangkan frekuensi adalah kecepatan cahaya dibagi dengan panjang gelombang (λ). Bilangan gelombang adalah (v) adalah satu satuan per panjang gelombang. (Dachriyanus, 2004). Kebanyakan penerapan  spektrofotometri UV-Vis pada senyawa organik didasarkan n-π* ataupun π-π* karena spektrofotometri UV-Vis memerlukan hadirnya gugus kromofor dalam molekul itu. Transisi ini terjadi dalam daerah spektrum (sekitar 200 ke 700 nm) yang nyaman untuk digunakan dalam eksperimen. Spektrofotometer UV-Vis yang komersial biasanya beroperasi dari sekitar 175 atau 200 ke 1000 nm. Identifikasi kualitatif senyawa organik dalam daerah ini jauh lebih terbatas daripada dalam daerah inframerah. Ini karena pita serapan terlalu lebar dan kurang terinci. Tetapi, gugus-gugus fungsional tertentu seperti karbonil, nitro dan sistem tergabung, benar-benar menunjukkan puncak yang karakteristik, dan sering dapat diperoleh informasi yang berguna mengenai ada tidaknya gugus semacam itu dalam molekul tersebut. (Day & Underwood, 1986)

D.  Hukum Lambert-Beer 

            Hukum Lambert-Beer (Beer`s law) adalah hubungan linearitas antara absorban dengan konsentrasi larutan sampel. Konsentrasi dari sampel di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer.

 Hukum Lambert-Beer terbatas karena sifat kimia dan faktor instrumen. Penyebab non linearitas (Dachriyanus, 2004):

·           Deviasi koefisien ekstingsi pada konsentrasi tinggi (>0,01 M), yang disebabkan oleh interaksi elektrostatik antara molekul karena jaraknya yang terlalu dekat. 

·           Hamburan cahaya karena adanya partikel dalam sampel. 

·           Flouresensi atau fosforesensi sampel. 

·           Berubahnya indeks bias pada konsentrasi yang tinggi. 

·           Pergeseran kesetimbangan kimia sebagai fungsi dari konsentrasi. 

·           Radiasi non-monokromatik; deviasi bisa  digunakan dengan menggunakan bagian datar pada absorban yaitu pada panjang gelombang maksimum. 

·           Kehilangan cahaya.  

E.   Instrumen Spektrofotometri UV-Vis

Instrumen pada spektrofotometri UV-Vis terdiri dari 6 komponen pokok:

1. sumber radiasi
2. Monokromator
3. wadah sampel (sel atau kuvet)
4. Detektor
5. Recorder
6. Read out  

Fungsi masing-masing bagian:

1.   Sumber sinar

Polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan berbagai macam rentang panjang gelombang. Untuk sepktrofotometer

·         UV menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavi hidrogen

·         VIS menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram

·         UV-VIS menggunan photodiode yang telah dilengkapi monokromator.

·         Infra merah, lampu pada panjang gelombang IR.

2.   Monokromator

Sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monaokromatis. Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan adalan gratting atau lensa prisma dan filter optik. Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah menjadi spektrum cahaya. Sedangkan filter optik berupa lensa berwarna sehingga cahaya yang diteruskan sesuai dengan warnya lensa yang dikenai cahaya. Ada banyak lensa warna dalam satu alat yang digunakan sesuai dengan jenis pemeriksaan. Pada gambar di atas disebut sebagai pendispersi atau penyebar cahaya. dengan adanya pendispersi hanya satu jenis cahaya atau cahaya dengan panjang gelombang tunggal yang mengenai sel sampel. Pada gambar di atas hanya cahaya hijau yang melewati pintu keluar. Proses dispersi atau penyebaran cahaya seperti yang tertera pada gambar.

3.   Sel sampel

Sebagai tempat meletakan sampel:

·      UV, VIS dan UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari kaca dan plastik dapat menyerap UV sehingga penggunaannya hanya pada spektrofotometer sinar tampak (VIS). Cuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan lebar 1 cm.

·      IR, untuk sampel cair dan padat (dalam bentuk pasta) biasanya dioleskan pada dua lempeng natrium klorida. Untuk sampel dalam bentuk larutan dimasukan ke dalam sel natrium klorida. Sel ini akan dipecahkan untuk mengambil kembali larutan yang dianalisis, jika sampel yang dimiliki sangat sedikit dan harganya mahal.

4.   Detektor

Menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan mengubahnya menjadi arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor :

·      Kepekaan yang tinggi

·      Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi

·      Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.

·      Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.

·      Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.

 Macam-macam detektor :

·      Detektor foto (Photo detector)

·      Photocell, misalnya CdS.

·      Phototube

·      Hantaran foto

·      Dioda foto

·      Detektor panas

5.   Read out

Merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik yang berasal dari detektor.

F.   Proses Absorbsi Cahaya pada Spektrofotometri

       Ketika cahaya dengan panjang berbagai panjang gelombang (cahaya polikromatis) mengenai suatu zat, maka cahaya dengan panjang gelombang tertentu saja yang akan diserap. Di dalam suatu molekul yang memegang peranan penting adalah elektron valensi dari setiap atom yang ada hingga terbentuk suatu materi. Elektron-elektron yang dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah (eksitasi), berputar (rotasi) dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi.

            Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahan elektron dari keadaan dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron ini disebut transisi elektronik. Apabila cahaya yang diserap adalah cahaya inframerah maka elektron yang ada dalam atom atau elektron ikatan pada suatu molekul dapat hanya akan bergetar (vibrasi). Sedangkan gerakan berputar elektron terjadi pada energi yang lebih rendah lagi misalnya pada gelombang radio.

            Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi suatu suatu yang ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada dalam sel sampel disinari dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. Ketika cahaya mengenai sampel sebagian akan diserap, sebagian akan dihamburkan dan sebagian lagi akan diteruskan.

             Pada spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau cahaya yang mengenai permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat diukur, yang dapat diukur adalah I_t/I₀ atau I₀/I_t (perbandingan cahaya datang dengan cahaya setelah melewati materi (sampel)). 

          Cahaya yang diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan cahaya yang hamburkan diukur sebagai transmitansi (T), dinyatakan dengan hukum lambert-beer atau Hukum Beer, berbunyi:

“jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya) yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal larutan”.

G.   Prinsip Kerja

       Adapun prinsip kerja alat spektrofotometer uv-vis yaitu sumber radiasi untuk spektroskopi UV-Vis adalah lampu tungsten. Cahaya yang dipancarkan sumber radiasi adalah cahaya polikromatik. Cahaya polikromatik UV akan melewati monokromator yaitu suatu alat yang paling umum dipakai untuk menghasilkan berkas radiasi dengan satu panjang gelombang (monokromator). Monokromator radiasi UV, sinar tampak dan infra merah adalah serupa yaitu mempunyai celah (slit), lensa, cermin dan perisai atau grating.

H.      Kelebihan dan Kekurangan Spektrofotometer UV-Vis

Kelebihan spektrofotometer UV-Vis:

·      Panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi.

·      Caranya sederhana

·      Dapat menganalisa larutan dengan konsentrasi yang sangat kecil

 Kekurangan spektrofotometer UV-Vis:

·      Absorbsi dipengaruhi oleh PH larutan,suhu dan adanya zat pengganggu dan kebersihan kuvet.

·      Hanya dapat dipakai pada daerah ultra violet yang panjang gelombang > 165 nm.

·      Pemakaian hanya pada gugus fungsional yang mengandung elektron valensi dengan energy eksitasi rendah.

·      Sinar yang dipakai harus monokromatis